زمان دما تعداد سیکل
واسرشت اولیه ۴ دقیقه ۰C94 ۱
واسرشت ۱دقیقه ۰C94 ۳۵
اتصال ۱.۵دقیقه ۰C62 ۳۵
گسترش ۲ دقیقه ۰C72 ۳۵
گسترش نهایی ۵ دقیقه ۰C72 ۱
۳-۸-۳- تشخیص فرآورده های PCR
به منظور تشخیص قطعات تکثیر یافته حاصل از واکنش PCR از الکتروفورز ژل آگاروز (افقی) استفاده شد. بدین منظور مشاهده مولکولهای DNA با اندازههای مختلف از ژل آگاروز با درصدهای مختلف استفاده میگردد. در این تحقیق جهت انجام الکتروفورز افقی، از ژل آگارز ۷/۱ درصد و بافر
۱X TBE استفاده گردید. مقدار فرآورده تزریق شده در هر چاهک µl 3 بود. همچنین نشانگر استاندارد(Fermenas) bp 100 در کنار سایر نمونهها قرار گرفت.
عمل الکتروفورز با شدت جریان ثابت و ولتاژ V/cm75 و به مدت ۹۰ دقیقه انجام شد. پس از رنگ آمیزی ژل به مدت ۱۵ دقیقه درون محلول µg/ml5/0 اتیدیوم بروماید، رنگزدایی توسط آب مقطر به مدت ۱۵ دقیقه انجام گرفت. برای بررسی کیفیت RNA و یا مشاهده باندهای مربوط به محصولات PCR از دستگاه UV Transilluminator استفاده میگردد که در آن اسیدهای نوکلئیک به صورت دو باند روشن در محدوده ی ۱۰۰۰ تا bp1100 مشاهده می شوند.

فصل چهارم

نتایج و بحث
۴-۱- نتایج
در نمونه برداری هایی که از خاک اطراف ریشه های محصولات خانواده کدوئیان مزارع استان خراسان رضوی انجام گرفت. در حین نمونه برداری در اکثر نواحی علایمی شبیه کمبود مواد غذایی مانند کاهش رشد، زردی و همچنین علایم مسمومیت غذایی و گرمازدگی مشاهده گردید که در بعضی موارد با علایم ناشی از فعالیت نماتد های انگل گیاهی اشتباه می شد ولی با بررسی دقیق سیستم ریشه ای گیاه و وجود یا عدم وجود گال و زخم بر روی آن و همچنین با اطلاعاتی که در رابطه با نوع خاک،دوره آبیاری،گیاهان کشت شده سابق، نوع و میزان کود و سموم مصرفی که از کشاورز گرفته می شد، اشتباهات در علایم فوق رفع می گردید.
علایم نماتدهای انگل گیاهی که در حین نمونه برداری بر روی خانواده کدوئیان مشاهده شد، عبارت بودند از: کوتولگی و کم رشدی، پژمردگی و شل شدن بوته در طول روز، زردی بوته ها،تنک و کوچک بودن سیستم ریشه ای نسبت به اندام های رویشی و وجود گال های ریز بر روی سیستم ریشه ای (مربوط به نماتد های جنس Meloidogyne ). در این تحقیق جمعا ۲۳ گونه نماتد متعلق به ۱۵ جنس (مربوط به زیر راسته Tylenchina) از مزارع محصولات خانواده کدوئیان در استان خراسان رضوی جداسازی و شناسایی گردید که در جدول در قسمت پیوست لیست شده است. گونه های Filenchus vulgaris ، Meloidogyne javanica ، Geocenamus tenuidens و Psilenchus iranicus به ترتیب بیشترین فراوانی را دارا می باشند.
۴-۲- شرح جنس ها و گونه های شناسایی شده
۴-۲-۱- جنس Aphelenchus Bastian,1865
نماتدهای کرمی شکل به طول ۲/۱ – ۵/۰ میلی متر، سر معمولا گرد تا پهن و همطراز بدن یا کمی فرورفته نسبت به آن، شبکه کوتیکولی سر ضعیف تا متوسط، استایلت ظریف و فاقدگره انتهایی، سطوح جانبی بدن دارای شیارهای طولی زیاد (حدود ۱۰ عدد یا بیشتر)، غده های مری از قسمت پشتی – جانبی ابتدای روده را می پوشانند. همیزونید معمولا قابل مشاهده و سه تا هشت شیار عرضی عقب تر از منفذ دفعی – ترشحی، غده پشتی مری و غده های زیرشکمی ترشحات خود را در حباب میانی مری به مجرای مری می ریزند. فرج در نیمه عقبی بدن، دارای یک تخمدان که به سمت جلوی بدن کشیده شده است. تخمک ها در یک ردیف، کیسه عقبی رحم در نیمه دوم بدن و در فاصله ی بین فرج تا مخرج قرار دارد. دم استوانه ای و فاسمید ها نزدیک انتهای دم هستند (نیکل، ۱۹۹۱). در نمونه های مورد بررسی از این جنس ۲ گونه شناسایی گردید.
۴-۲-۱-۱- گونه Aphelenchus avenae Bastian , 1865
در نمونه های مورد بررسی نر مشاهده نشد.
مشخصات و اندازه های گونه مورد مطالعه با کلید شناسایی گونه های Aphelenchus مورد مقایسه قرار گرفت. فاکتور های مورد مطالعه با شرح اصلی گونه Aphelenchus avenae مطابقت نشان می دهد. این گونه اولین بار توسط باستین (۱۸۶۵) از میان برگ ها و غلاف کاه های باقی مانده پس از درو در زمین های انگلستان گزارش شد. در ایران گونه مذکور از خاک مزارع و باغ های مختلف کشور توسط محققین مختلف گزارش شده است. در این بررسی، گونه مورد مطالعه از خاک اطراف ریشه های طالبی و تیل مگسی از روستای رئیسی واقع در جاده نیشابور- کاشمر جمع آوری و شناسایی گردید.
۴-۲-۱-۲- گونه Aphelenchus isomerus Anderson & Hooper,1980
در نمونه های مورد بررسی نر مشاهده نشد.
گونه Aphelenchus isomerus با داشتن واژن ایزومورفیک و متقارن، عریض بودن سطوح جانبی بدن و شیارهای طولی ظریف آن، ظریف بودن شیارهای عرضی بدن از سایر گونه ها به خوبی متمایز می گردد. مشخصات و اندازه های افراد مورد مطالعه با شرح اصلی گونه که توسط اندرسون و هوپر در سال ۱۹۸۰ ارائه شده مطابقت نشان می دهد. گونه مورد مطالعه با گونه های مشابه نیز مورد مقایسه قرار گرفت. گونه Aphelenchus avenae با داشتن واژن نامتقارن و گونه Aphelenchus solani با داشتن کیسه عقبی رحم کوتاهتر (سه برابر عرض بدن در ناحیه مخرج و در مقابل هفت برابر عرض بدن در ناحیه مخرج)، طول استایلت بلندتر (۲۰ میکرومتر در مقابل ۱۱ تا ۱۲ میکرومتر) از گونه مورد مطالعه متمایز می گردند. این گونه اولین بار توسط اندرسون و هوپر در سال ۱۹۸۰ از مناطق با آب و هوای گرم اروپا، کانادا و بعضی از کشورهای دیگر گزارش گردید. در ایران گونه مذکور اولین بار توسط رفیعی و همکاران (۱۳۸۷) از خاک اطراف ریشه‌های خیار از منطقه جیرفت جمع آوری و شناسایی گردید. در این بررسی گونه مذکور از خاک اطراف ریشه‌های طالبی و گرمک و خیار از روستاهای قلعه بالا و تربقان در شهرستان کاشمرجمع آوری و شناسایی گردید.
جدول ۴-۱: خصوصیات مورفومتریک دوگونه از جنس Aphelenchus (اندازه ها بر حسب میکرومتر).

Species Aphelenchus avenae Aphelenchus isomerus
Characters Female Female
N 6 5

L (610-646)625.6±۱۴.۰۸ (۶۴۰-۸۵۰)۷۴۴±۸۴.۴۳
a (26.4-36.4)30.2±۴.۱۷ (۳۰.۷-۳۸.۵)۳۳.۲۶±۳.۱۳
b (4.6-5.3)5.02±۰.۲۸ (۴.۷-۵.۶)۵.۰۸±۰.۳۴
b’ (3.1-3.6)3.3±۰.۲۱ (۳.۷-۴.۳)۴.۰۴±۰.۲۴
c (27.4-31.7)29.6±۱.۷۴ (۲۶.۳-۳۲.۷)۲۹.۹±۲.۵۳
c’ (1.6-2.4)2.02±۰.۳۱ (۱.۷-۲.۶)۲.۱۴±۰.۳۶
v (0.76-0.79)0.77±۰.۰۱ (۰.۶۸-۰.۷۸)۰.۷۳±۰.۰۴
v’ (0.77-0.79)0.78±۰.۰۰۷ (۰.۷۱-۰.۷۹)۰.۷۴±۰.۰۳
Stylet (14-15)14.6±۰.۵۴ (۱۱-۱۲)۱۱.۴±۰.۵۴
m (0.39-0.44)0.41±۰.۰۲ (۰.۳۳-۰.۴۲)۰.۳۸±۰.۰۳
MB (0.51-0.61)0.56±۰.۰۳۷ (۰.۴۴-۰.۵۹)۰.۵۱±۰.۰۷
G1 (29.2-35.6)33.16±۲.۴۶ (۳۶.۷-۴۶.۵)۴۰.۵۶±۴.۰۴
PVS (52-73)64.4±۹.۳۹ (۷۱-۸۰)۷۵.۶±۳.۳۶
Tail length (20-26)22.8±۲.۲۸ (۲۴-۳۱)۲۶.۶±۲.۷۰

۴-۲-۲- جنس Basiria siddiqi,1959
نماتدهایی کرمی شکل که طول بدنشان حدود ۱ میلی متر یا کمتر و بعد از تثبیت به صورت مستقیم و یا از طرف شکمی خمیده، کوتیکول دارای شیارهای عرضی ظریف، سطوح جانبی بدن دارای چهار شیار طولی، شیارهای داخلی آن نسبتاً نامشخص، منافذ آمفیدی برجسته، شکافی شکل یا به صورت V معکوس، محل آنها در پایه لب های جانبی، فاسمید ها نامشخص، سربلند، گرد و صاف، شبکه کوتیکولی سرضعیف، استایلت باریک به طول ۹ تا ۱۳ میکرومتر با گره های کوچک گرد، فاصله محل ریزش غده پشتی مری از زیرگره های استایلت به اندازه یک برابر طول استایلت، حباب میانی مری رشد ضعیفی دارد. غده های انتهایی مری نسبت به روده به صورت اتصالی، دریچه بین مری و روده مشخص، فرج در فاصله ۶۰ تا ۷۰ درصدی طول بدن قرار دارد، دارای یک تخمدان که به سمت جلوی بدن کشیده شده، کیسه عقبی رحم کوتاهتر از عرض بدن در ناحیه فرج، دم بلند و نخی شکل، با انتهای چماقی شکل، گرد یا نوک تیز، اندام تناسلی نر به طول ۱۴ تا ۲۴ میکرومتر و بورسا محدود به ناحیه دفعی- تناسلی، گوبرناکولوم ساده (صدیقی، ۲۰۰۰) در نمونه های مورد مطالعه از این جنس یک گونه شناسایی شد.
۴-۲-۲-۱- گونه Basiria graminophila siddiqi,1959
در نمونه های مورد بررسی نر مشاهده نشد.
با استفاده از کلید شناسایی گونه های جنس Basiria که توسط کارگر و گرارت (۱۹۹۸) ارائه شده، مشخصات افراد نمونه با گونه B. graminophila مطابقت نشان می دهد. مشخصات و اندازه های افراد نمونه با شرح گونه B. graminophila که توسط زیدان و گرارت که در سال ۱۹۹۱ ارائه شده، نیز مقایسه گردید. تمام مشخصات افراد نمونه با گونه مذکور مطابقت نشان می دهد.
همچنین افراد نمونه با گونه مشابه B. aberans نیز مقایسه شد. در گونه مذکور محل ریزش غده پشتی مری از زیر گره های استایلت ۱۰ تا ۱۳ میکرومتر، استایلت معمولاً خمیده و بدن C شکل است. ولی گونه مورد مطالعه با داشتن استایلت و بدن مستقیم وراست و فاصله محل ریزش غده پشتی مری از زیر گره‌های استایلت ۴/۲ تا ۷/۳میکرومتر، از گونه مذکور متمایز می گردد. گونه B. graminophila برای اولین بار توسط صدیقی (۱۹۵۹) از روی ریشه های یک نوع گراس (Cynodon dactylon) و همچنین از خاک اطراف ریشه‌های مرکبات در هند گزارش شد. در ایران، پدرام و همکاران (۱۳۸۰) گونه مذکور را از خاک مزارع برنج استان گیلان و کارگر (۱۳۸۵) از خاک اطراف ریشه های چغندرقند استان همدان جمع آوری و گزارش نمودند. در این بررسی گونه مورد مطالعه از خاک اطراف ریشه های

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید