جامد فرو برده و با دقت دهانه لوله در وسط لام قرار داده شد. بدین طریق پارافین مذاب بر روی لام منتقل شده و پس از سرد شدن حلقه پارافین کامل ایجاد می گردد. پس از ایجاد حلقه ، توسط پنبه آغشته به الکل سطح داخلی حلقه تمیز و سپس یک قطره کوچک گلیسیرین در وسط حلقه پارافین قرار داده شد. با استفاده از بینوکولار از ظرف حاوی نماتد، با دقت نماتد های بالغ مربوط به یک جنس انتخاب و با کمک سوزن سر کج تمیزی به داخل قطره گلیسیرین منتقل و با کمک سوزن، گلیسیرین را به آرامی پخش و نماتد ها با احتیاط در وسط قطره گلیسیرین و در سطح لام منظم گردید. سپس لامل تمیزی به آرامی و به گونه ای که حباب هوا در فضای بین لام و لامل تشکیل نگردد، روی حلقه پارافین قرار می گرفت. بعد از این مرحله، لام را به مدت چند ثانیه از روی شعله چراغ الکلی عبور داده تا حلقه پارافین ذوب شود و بلافاصله لام را به آرامی بر روی یک سطح صاف بدون شیب قرار داده تا پارافین به طور یکنواخت سفت شود. جهت جلوگیری از نفوذ هوا، اطراف لامل با لاک بیرنگ یا چسب کانادابالزام مسدود می شود.
۳-۵-۲- تهیه برش از شبکه کوتیکولی انتهای بدن ماده های بالغ جنس Meloidogyne و تهیه اسلاید میکروسکوپی
ابتدا نماتدهای ماده استخراج شده به آرامی به یک قطره اسید لاکتیک در روی یک پتری پلاستیکی منتقل شدند.سپس با استفاده از تیغ اسکالپل تیز، انتهای بدن نماتد برش داده شد. با استفاده از یک سوزن ظریف همراه با وارد کردن ضربات آرام به ناحیه برش داده شده، محتویات بدن از قسمت برش داده شده تخلیه گردید. این قطعه برش داده شده به یک قطره گلیسرین روی یک لام شیشه ای منتقل شد و پس از قرار دادن لامل بر روی آن، دور لامل با استفاده از لاک بی رنگ مسدود شد.
۳-۶- مشخصات مورفولوژیک و مورفومتریک مورد استفاده در تشخیص گونه ها
– سر(Lip region – Cephalic region ): وضع قرار گرفتن آن نسبت به بدن (همطراز یا فرو رفته)، دارای شیار یا بدون شیار، شکل سر، شبکه کوتیکولی سر، وجود آمفیدها و وضعیت پاپیل ها.
– استایلت (Stylet – Spear ): شکل و نحوه قرار گرفتن گره های آن، فاصله محل ریزش غده پشتی مری تا گره های استایلت.
– مری (Oesophagus ): شکل عمومی آن، شکل و وضعیت حباب میانی مری، ابعاد و وضعیت دریچه میانی آن، محل قرار گرفتن حلقه عصبی، شکل و نحوه اتصال حباب انتهای مری به روده (اتصالی یا هم پوشانی) و موقعیت غده های آن، وجود یا عدم وجود دریچه کاردیا (دریچه بین مری و روده).
– منفذ ترشحی(Excretory pore ): محل آن و وضع همیزونید و همیزونیون نسبت به آن، وجود یا عدم وجود دایرید و محل آن، شیارهای طولی در سطوح جانبی بدن و تعداد آنها، شیارهای عرضی بدن، صاف یا مشبک بودن شیارهای سطوح جانبی، وجود یا عدم وجود زواید روی شیارهای عرضی بدن.
– دستگاه تولید مثلی(Reproductive system ): ماده ها- تعداد تخمدان و وضعیت آن(ساده یا برگشتی)، وضع شکاف تناسلی، پرده دار یا بدون پرده بودن فرج، تعداد ردیف تخمک، وضع کیسه ذخیره اسپرم نسبت به تخمدان، وجود یا عدم وجود اسپرم و شکل آن، وجود یا عدم وجود کیسه عقبی در یک تخمدانه ها، وجود یا عدم وجود زواید اپیپتیگما۲ در فرج.
نرها- شکل اندام تناسلی نر، شکل گوبرناکولوم۳ و نحوه قرار گرفتن آن، وجود یا عدم وجود بورسا در نرها و وضعیت آن، وجود یا عدم وجود زواید هیپوپتیگما۴ در محل خروج اندام تناسلی.
– دم (Tail ): شکل دم، شیاردار یا صاف بودن انتهای آن، محل فاسمید ها، مخرج و نحوه اتصال آن به راست روده، وجود و عدم وجود بورسا.
جهت شناسایی افراد جنس Meloidogyne علاوه بر لاروهای سن دوم و نرها، از شبکه کوتیکولی انتهای بدن ماده های بالغ نیز استفاده شد که به شرح زیر آمده است. پس از تهیه اسلاید میکروسکوپی از انتهای بدن ماده های بالغ، مشخصات مورفولوژیکی و مورفومتریکی آن مانند، شکل عمومی و کلی شبکه، وجود یا عدم وجود خطوط جانبی، فرورفتگی در محل خطوط جانبی، ارتفاع کمان پشتی و شکل آن، وجود یا عدم وجود نقاط در ناحیه دم، شکل شیار، ظریف یا ضخیم بودن شیارها، پیوستگی یا عدم پیوستگی شیارها، اندازه فرج، فاصله فرج تا مخرج، فاصله فاسمیدها، مشخص بودن انتهای دم و شکل آن، طول کمان پشتی، طول و عرض شبکه کوتیکولی، فاصله شیارها از هم، وجود یا عدم وجود شیار های متصل به ناحیه فرج، مورد بررسی قرار گرفتند.
۳-۶-۱- مورفومتری و رسم تصاویر
جهت اندازه گیری و رسم تصاویر قسمت های مختلف بدن نماتد ها، از میکروسکوپ دو چشمی الیمپوس۵ BH2 مجهز به لوله ترسیم۶ استفاده گردید. (لازم به ذکر است قبل از بدست آوردن اندازه ها، لوله ترسیم برای تمام بزرگنمایی های میکروسکوپ تنظیم و کالیبره گردید).
پارامترهایی که در مورفومتری محاسبه و اندازه گیری شد، به شرح زیر آمده است:
L = طول بدن بر حسب میلیمتر
a = نسبت طول بدن به بزرگترین عرض بدن
b = نسبت طول بدن به طول مری (از سر تا محل اتصال مری به روده)
b’ = نسبت طول بدن به فاصله سر تا انتهای غده های مری (در حالت همپوشانی مری)
c = نسبت طول بدن به طول دم (دم: از مخرج تا انتهای بدن)
c’ = نسبت طول دم به عرض بدن در ناحیه مخرج
v = نسبت فاصله بین سر تا فرج به طول بدن بر حسب درصد
v’ = نسبت فاصله بین سر تا فرج به فاصله سر تا مخرج بر حسب درصد
T = نسبت فاصله بین ابتدای لوله جنسی نر تا منفذ دفعی- تناسلی۷ به طول بدن بر حسب درصد
m = نسبت قسمت مخروطی استایلت به کل استایلت بر حسب درصد
O = نسبت فاصله بین محل ریزش غده پشتی مری تا گره های استایلت به طول استایلت
M.B = نسبت فاصله بین سر تا مرکز حباب میانی مری به طول مری بر حسب درصد (در حالتی که نحوه اتصال مری به روده از نوع اتصالی۸ باشد).
G1 = نسبت طول تخمدان جلویی به طول بدن بر حسب درصد
G2 = نسبت طول تخمدان عقبی به طول بدن بر حسب درصد
Ran = تعداد شیار های عرضی بدن در ناحیه دم
Spear = طول استایلت بر حسب میکرومتر
Tail = طول دم بر حسب میکرومتر
Clear- tail length = طول بخش شفاف انتهای دم۹
Spicule = طول اسپیکیول بر حسب میکرومتر
Gubernaculum = طول گوبرناکولوم بر حسب میکرومتر
در این بررسی منبع اصلی برای تشخیص جنس ها،گونه ها و تعیین جایگاه آنها در طبقه بندی، مجموعه A reappraisal of tylenchida(Nemata)”” بوده که توسط پنج تن از دانشمندان مشهور رده بندی نماتدهای انگل گیاهی تهیه شده است (فورچونر.، گرارت.، لوک.، مگنتی و رسکی، ۱۹۸۷).
علاوه بر مجموعه مذکور، برای تشخیص جنس ها و شرح آنها از کتاب Tylenchida که توسط صدیقی (۲۰۰۰) نوشته شده، استفاده گردید و برای تشخیص گونه ها از کلید های موجود مربوط به هر گونه استفاده شد. برای مقایسه افراد نمونه و گونه های مورد مطالعه با شرح اصلی گونه و گونه های مشابه، از مجموعه C.I.H10 ، مجلات Nematologica ، Revue de Nematoloy ، Journal of Nematology ، Fundamental Applied Nematology ، Journal of Zoology استفاده شد. همچنین برای شناسایی افراد جنس Meloidogyne از کتاب (Meloidogyne species) Identification of root- knot nematodes نوشته جپسون(۱۹۸۷) و جهت مقایسه گونه های گزارش شده از ایران با نمونه های جمع آوری شده در این بررسی، از مجلات بیماریهای گیاهی، خلاصه مقالات کنگره های گیاهپزشکی و پایگاههای اطلاع رسانی Irandoc و SID استفاده شد.
۳-۷- جداسازی نماتد های ریشه گرهی و خالص سازی آنها
برای بدست آوردن جمعیت خالص از هر نمونه، ریشه های حاوی گره با آب شسته شدند تا ذرات خاک از آنها جدا گردند. سپس در زیر بینوکولار از هر نمونه یک کیسه تخم بزرگ که حاوی تعداد تخم بیشتری بود، انتخاب گردید و درون یک پتری حاوی آب مقطر سترون قرار داده شد. این پتری ها در انکوباتور ۲۸ درجه سانتیگراد تا زمان خروج حداکثر لاروهای سن دو از تخم نگهداری گردیدند. همچنین برای بررسی اینکه در یک ریشه یک گونه یا بیشتر وجود دارد، ماده های متورم از قسمتهای مختلف ریشه جدا و برش انتهای بدن از آنها نیز تهیه شد. پس از خروج حداکثر لاروها، سوسپانسیون لارو به گلخانه منتقل شد و هر نمونه داخل چندین سوراخ که در مجاورت یک نشاء گوجه فرنگی رقم Red clued ایجاد شد، ریخته شدند. نشاء ها در مرحله ۴-۲ برگی بودند. پس از مایه زنی، آبیاری مختصری صورت گرفت و بعد از آن هر دو روز یکبار به صورت مرتب گلدان ها آبیاری شدند.
۳-۸- استخراج DNA ژنومی چند جمعیت از جنس Filenchus :
برای این منظور در مورد جنس Filenchus از روش جویس و همکاران(۱۹۹۴) استفاده شد. در مورد نماتد های ریشه گرهی، بر روی یک لام شیشه ای تمیز lµ۱۶ آب مقطر دو بار سترون ریخته شد. سپس تعدادی نماتد بالغ در داخل این آب مقطر انداخته شد. با استفاده از یک اسکالپل استریل، نماتدها تا حد امکان تکه تکه شدند. سپس با استفاده از سمپلر این مجموعه به یک میکروتیوب ml2/0 منتقل شدند. مقدارµl20 بافر استخراج ( ۲۰Tween %4.5 ،mM DTT10 ، ۲Mgcl mM15 ، ۸pH mM Tris-Hcl100
،mM KCL500) اضافه شد. سپس µl4 پروتئیناز K (600 µg/ml) اضافه شد و این میکروتیوب ها به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۰C80- قرار داده شدند. سپس یک ساعت در دمای ۰C65 و ۱۰ دقیقه در دمای ۰C95 قرار داده شدند. سپس یک سانتریفیوژ rpm13000 به مدت ۲ دقیقه انجام شد و میکروتیوب ها در فریزر ۲۰- قرار داده شدند.
۳-۸-۱-انجام واکنش PCR :
جهت انجام واکنش PCR از یک جفت آغازگر عمومی به نام های TW81 و AB28 که برای تکثیرنواحی کامل ITS2+5.8S+ITS1 وبخش هایی ازS18 و S28 طراحی شده اند، استفاده شد(جویس و همکاران۱۹۹۴).

توالی نوکلئوتیدی آغازگرها به صورت زیر می باشد:
TW81 (5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′)
AB28 (5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′)
تکرار واکنش زنجیره ای پلیمراز باعث سنتز رشته های DNA جدید از روی رشته الگو
می شود. برای تکثیر DNA از روش دستی استفاده شد.
۳-۸-۲-روش دستی PCR
به منظور شروع آزمایش ابتدا مواد لازم از شرکت سیناژن تهیه گردید که به شرح زیر
می باشد:
جدول ۳-۳: اجزاء واکنش PCR برای ژن ITS
مواد مصرفی مقدار مورد استفاده
بافر PCR (x10) µl5/2
کلرور منیزیوم(۲MgCl) mM 25 µl1
dNTPs mM10 µl5/0
DNAالگو µl1
آغازگر رفت µl1
آغازگر برگشت µl1
آنزیم Taq µl3/0
آب مقطر استریل µl7/17
حجم نهایی µl25

با توجه به حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر، مخلوط واکنش درون میکروتیوب های µl2/0 ریخته شد. برنامه PCR به صورت زیرمی باشد:
جدول ۳-۴: برنامه PCR مورد استفاده برای ژن ITS
نام مرحله واکنش

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید