longimatricalis و Ektaphelenchoides compsi برای اولین بار از ایران گزارش شدند.
ابولی پور وهمکاران نیز در سال ۱۳۸۷ در بررسی تاثیر نماتد ریشه گرهی بر گلدهی و ماندگاری خیار گلخانه ای و محلی دریافت که رقم دستگردی که رقم مزرعه ای می باشد متحمل ترین رقم نسبت به نماتد ریشه گرهی Meloidogyne javanica میباشد. همجنین آنها در ارزیابی ارقام گلخانه ای خیار نسبت به این نماتد به حساسیت تمام ارقام رایج گلخانه ای پی برده و دو رقم محلی دستگردی و چمبر رامتحمل شناختند.
در سال ۱۳۸۴ جباری و همکاران در بررسی فون نماتدهای سبزیجات اطراف تبریز گونه های Filenchus vulgaris و Heterodera cruciferae را از خاک اطراف ریشه های کدو و سایر سبزیجات جداسازی کردند.

فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- نمونه برداری
به منظور شناسایی نماتد های انگل گیاهی مزارع کدوئیان استان خراسان رضوی، طی سال های ۸۸ و ۸۹ تعداد ۵۶ نمونه خاک و ریشه و همچنین تعداد۱۶نمونه مربوط به نماتدهای ریشه گرهی از مزارع کدوئیان استان جمع آوری گردید. نمونه برداری بسته به نوع مزرعه به حرکت در طول دو قطر مزرعه یا به صورت مارپیچی یا زیگزاکی انجام شد. بدین منظور، در طول مسیر حرکت به فواصل هر ۵ تا ۱۰ متر یک نمونه از منطقه اطراف ریشه (عمق ۱۰ تا ۳۰) سانتی متری برداشته و در پایان بعد از مخلوط نمودن تمام نمونه های یک مزرعه، یک نمونه یک کیلویی (همراه با ریشه های آلوده) که نماینده کل مزرعه است، انتخاب و در کیسه پلاستیکی قرار داده شد. سپس نمونه ها به آزمایشگاه تحقیقات بیماری های گیاهی منتقل و در یخچال در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شدند. بخشی از ریشه های آلوده جهت استخراج ماده های بالغ جنس Meloidogyne و تهیه برش از انتهای بدن آنها به طور جداگانه در محلول فرمالین ۵ درصد نگه داری شد.مشخصات نمونه های خاک جمع آوری شده از هر ناحیه از منطقه خراسان رضوی و نقشه علامت گذاری شده توسط دستگاه GPS در زیر آورده شده است:
جدول۳-۱: مکان، زمان و نوع آبیاری در نمونه های خاک جمع آوری شده
ردیف
زمان نمونه برداری
مکان نمونه برداری
نوع آبیاری
ردیف
زمان نمونه برداری
مکان نمونه برداری

نوع آبیاری
۱
مرداد۸۸
خواجه ربیع
غرقابی
۲۸
تیر ۸۹
کاشمر(قلعه بالا)
غرقابی
۲
مرداد۸۸
خواجه ربیع
غرقابی
۲۹
تیر ۸۹
کاشمر(قلعه بالا)
غرقابی
۳
مرداد۸۸
کلات (سولاخه)
غرقابی
۳۰
تیر ۸۹
کاشمر(قلعه بالا)
غرقابی
۴
مرداد۸۸
کارده
غرقابی
۳۱
تیر ۸۹
کاشمر(فیض آباد)
غرقابی
۵
مرداد۸۸
کارده
غرقابی
۳۲
تیر ۸۹
کاشمر(فیض آباد)
غرقابی
۶
مرداد۸۸
نیشابور(باغشن)
غرقابی
۳۳
تیر ۸۹
کاشمر(تربقان)
غرقابی
۷
مرداد۸۸
نیشابور(باغشن)
غرقابی
۳۴
تیر ۸۹
کاشمر(تربقان)
غرقابی
۸
مرداد۸۸
سبزوار(ده نوی)
غرقابی
۳۵
تیر ۸۹
کاشمر(ریوش)
غرقابی
۹
مرداد۸۸
سبزوار(ده نوی)
غرقابی
۳۶
مرداد۹۰
تربت جام
غرقابی
۱۰
مرداد۸۸
نیشابور(میرآباد)
غرقابی
۳۷
مرداد۸۹
تربت جام
غرقابی
۱۱
مرداد۸۸
نیشابور(بلغشه)
غرقابی
۳۸
مرداد۸۹
کاشمر(عطائیه)
غرقابی
۱۲
مرداد۸۸
نیشابور(بلغشه)
غرقابی
۳۹
مرداد۸۹
نیشابور(قاسم آباد)
غرقابی
۱۳
مرداد۸۸
نیشابور(کارجیج)
غرقابی
۴۰
مرداد۸۹
نیشابور(رئیسی)
غرقابی
۱۴
مرداد۸۸
نیشابور(اسلامیه)
غرقابی
۴۱
مرداد۸۹
نیشابور(رئیسی)
غرقابی
۱۵
مرداد۸۸
قوچان(کلاته یزدیها)
غرقابی
۴۲
مرداد۸۹
سرخس
غرقابی
۱۶
شهریور ۸۸
قوچان(کلاته یزدیها)
غرقابی
۴۳
مرداد۸۹
سرخس
غرقابی
۱۷
شهریور ۸۸
قوچان(نوری)
غرقابی
۴۴
مرداد۸۹
سرخس
غرقابی
۱۸
شهریور ۸۸
قوچان(نوری)
غرقابی
۴۵
شهریور۸۹
جیم آباد
غرقابی
۱۹
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۴۶
شهریور۸۹
جیم آباد
غرقابی
۲۰
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۴۷
شهریور۸۹
جیم آباد
غرقابی
۲۱
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۴۸
شهریور۸۹
جیم آباد
غرقابی
۲۲
شهریور ۸۸
چناران(کمبلان)
غرقابی
۴۹
شهریور۸۹
جیم آباد
غرقابی
۲۳
شهریور ۸۸
چناران(کمبلان)
غرقابی
۵۰
شهریور۸۹
فریمان
غرقابی
۲۴
شهریور ۸۸
کاظم آباد
غرقابی
۵۱
شهریور۸۹
فریمان
غرقابی
۲۵
شهریور ۸۸
کاظم آباد
غرقابی
۵۲
اردیبهشت۹۰
کاشمر(قلعه بالا)
غرقابی
۲۶
شهریور ۸۸
بزرگراه باغچه
غرقابی
۵۳
اردیبهشت۹۰
حصار سرخ
غرقابی
۲۷
شهریور ۸۸
بزرگراه باغچه
غرقابی
۵۴
اردیبهشت۹۰
حصار سرخ
غرقابی

شکل ۳-۱: نقشه مکان های نمونه برداری
۳-۲- استخراج نماتدها
۳-۲-۱- استخراج نماتدهای کرمی شکل از خاک
جهت استخراج نماتدها از خاک، روش تکمیل شده دگریس (۱۹۶۹) و تغییر یافته جن کینز (۱۹۶۴) مورد استفاده قرار گرفت. مقدارk 250 تا ۳۰۰ گرم از نمونه خاک را داخل یک سطل ریخته، بعد از اضافه کردن مقدار کافی آب، آنرا با دست خوب بهم زده تا مخلوط شود. جهت ته نشین شدن املاح سنگین، محلول حدود ۱۰ تا ۱۵ ثانیه به حال خود رها شده، سپس به آرامی به سطل دیگری منتقل شد. در این عمل باید دقت کرد که گل و املاح ته نشین شده در ته سطل اول به داخل سطل بعدی سرازیر نشود. عمل شست و شوی خاک ته سطل اول به همین ترتیب سه بار تکرار گردید و در نهایت آب حاصل از کل شست و شو در یک سطل جمع آوری شد. جهت صاف کردن سوسپانسیون فوق، ابتدا از یک الک با سوراخ های به قطر ۱ میلیمتر، سپس از الک هایی با سوراخ هایی به قطر ۲۵۰ میکرومتر (۶۰ مش)، ۱۵۰ میکرومتر(۱۰۰ مش) و ۳۸ میکرومتر(۴۰۰ مش) عبور داده شد. سپس محتویات سطح الک ها به یک مزور یک لیتری منتقل گردید و برای اینکه محلول بیشتر صاف شود، حدود نیم تا یک ساعت به حال خود رها شد. در این مدت نماتدها ته نشین شده، بقایای گیاهی و سایر مواد زائد در سطح آب جمع و به طریقی از سطح آب خارج شدند. سپس متناسب با حجم لوله‌های سانتریفیوژ مقداری از آب مزور را تخلیه کرده و املاح ته نشین شده را به همراه مقدار کم آب بهم زده، به مقدار و وزن مساوی در لوله های سانتریفیوژ تقسیم گردید و لوله ها درون سانتریفیوژ قرار داده شد. محتوی داخل لوله ها در دو مرحله سانتریفیوژ رسوب کردند. در مرحله اول آب رویی دور ریخته شد. در مرحله دوم سانتریفیوژ، از محلول شکر استفاده شد. بدین ترتیب بعد از اضافه شدن محلول شکر به لوله های حاوی رسوب حاصل از سانتریفیوژ اول، محتویات لوله ها با کمک میله شیشه ای به آرامی همزده شد و لوله ها داخل سانتریفیوژ قرار گرفت و به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ انجام شد. در این عمل ذرات خاک ته نشین شده و نماتدها در محلول شکر به صورت شناور باقی می مانند. بعد از اتمام سانتریفیوژ بلافاصله محلول رویی لوله ها در زیر جریان ملایم آب روی سطح الک ۳۸ میکرومتری ریخته شد. سپس سطح الک توسط مقداری آب به داخل یک پتری دیش کوچک شسته شد با این عمل نماتدهای نمونه خاک به همراه کمی خاشاک و جانوران ریز و تخم نماتدها استخراج شد. برای تهیه ۱ لیتر محلول شکر با وزن مخصوصgr/cm3 18/1، مقدار ۴۵۴گرم شکر را در مقداری آب حل کرده و به حجم یک لیتر رسانده شد.
جدول ۳-۲: مشخصات ریشه های آلوده به نماتد Meloidogyneجمع آوری شده
ردیف
زمان نمونه برداری
مکان نمونه برداری
نوع آبیاری
ردیف
زمان نمونه برداری
مکان نمونه برداری
نوع آبیاری
۱
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۵
شهریور ۸۸
جیم آباد
غرقابی
۲
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۶
شهریور ۸۸
جیم آباد
غرقابی
۳
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۷
شهریور ۸۸
جیم آباد
غرقابی
۴
شهریور ۸۸
قوچان(امرغان)
غرقابی
۸
شهریور ۸۸
جیم آباد
غرقابی

۳-۳- استخراج ماده های متورم جنس Meloidogyne از ریشه
نماتدهای ماده متورم به تنهایی یا به صورت چند تایی در داخل بافت ریشه قرار دارند. برای استخراج آنها از بافت گیاهی، ریشه های حاوی گره را در زیر جریان ملایم آب قرار داده تا ذرات خاک از آنها شسته شود وسپس به قطعات ۳ تا ۵ سانتی متری برش داده و در داخل یک ظرف حاوی مقداری آب قرار داده، سپس در زیر بینوکولار با استفاده از اسکالپل با دقت بافت ریشه را شکافته و با احتیاط ماده های متورم از داخل بافت بیرون کشیده شدند. پس از جدا کردن تعداد کافی نماتد، از شبکه کوتیکولی انتهای بدن۱ آنها برش تهیه شد.
۳-۴- کشتن، ثابت کردن و انتقال نماتدها به گلیسیرین خالص
پس از استخراج نماتدها به منظور نگه داری آنها در دراز مدت لازم است عملیاتی در جهت کشتن، ثابت کردن و انتقال آنها به گلیسیرین خالص انجام شود. بدین منظور از روش تکمیل شده دگریس(۱۹۶۹) استفاده شد. نماتدهای استخراج شده به داخل یک پتری کوچک انتقال یافته، جهت کشتن و ثابت کردن آنها ابتدا آب ظرف حاوی نماتد تخلیه گردید. این کار توسط یک پیپت پاستور بسیار نازک در زیر بینوکولار و با دقت به طوریکه نماتد ها مکیده و دور ریخته نشود، انجام گرفت ودر مواردی نیز با استفاده از نوارهای باریک دستمال کاغذی (که یک سر آن داخل پتری و سر دیگرش خارج از پتری است) عمل آبگیری انجام شد. پس از خروج آب از پتری حاوی نماتد ، محلول فیکساتیو ۱ (۸۸ قسمت آب مقطر، ۱۰ قسمت فرمالدهید ۳۷ درصد تجاری، ۱ قسمت اسید استیک و یک قسمت گلیسیرین) را تا ۷۸ درجه سانتی گراد گرم کرده و یکباره روی نماتد های داخل پتری ریخته، سپس پتری را به مدت ۲۴ ساعت در محیط الکلی اشباع (این محیط با استفاده از دسیکاتور کوچکی که به اندازه ۱/۰ حجم اش الکل اتیلیک ۹۶ درصد داخل آن ریخته شده فراهم گردید) داخل انکوباتور با حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد. بعد از گذشت مدت زمان مذکور محلول فیکساتیو ۱ خارج و محلول فیکساتیو ۲ (۹۵ قسمت الکل اتیلیک ۹۶ درصد و ۵ قسمت گلیسیرین ) به پتری حاوی نماتد اضافه گردید، سپس به مدت ۴ ساعت در محیط الکلی اشباع در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت. مجددا بعد از گذشت مدت زمان مذکور و پس از خارج کردن فیکساتیو ۲ ، محلول فیکساتیو ۳ (۵۰ قسمت الکل و ۵۰ قسمت گلیسیرین ) به پتری اضافه شد. این بار پتری حاوی نماتد در صفحه درون انکوباتور در محیط غیر الکلی به مدت حداقل ۴ ساعت در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از طی شدن تمام مراحل فیکساتیو جهت جلوگیری از جذب رطوبت، پتری حاوی نماتد در دسیکاتور حاوی کلرور کلسیم نگهداری شد.
۳-۵- تهیه اسلاید های میکروسکوپی
جهت شناسایی نماتدها و بررسی های میکروسکوپی، اسلاید های دایمی از نماتدهای جمع آوری شده تهیه گردید
۳-۵-۱- تهیه اسلایدهای دایم از نماتدهای کرمی شکل
ابتدا در وسط یک لام تمیز، توسط دهانه لوله آزمایش به قطر ۱۵ میلیمتر یک حلقه پارافین ایجاد

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید