سرم بالاتری نسبت به بیماران با سطوح هموگلوبین گلیکوزیله ۷ درصد داشتند. بنابراین، تنظیم قند خون مختل شده در بیماران دیابتی با سطح واسپین سرم افزایش یافته مرتبط شده است. همچنین کاهش سطح واسپین سرم در بیماران زن مبتلا به میکروآنژیوپاتی (رتینوپاتی دیابتی، نفروپاتی و نوروپاتی) گزارش شده است. در مقابل، در افراد غیر دیابتی، سطوح واسپین سرم به شاخص های حساسیت به انسولین بستگی ندارد(۷۸).
۲-در مطالعه دوم که توسط Escobar-Morreale HF و همکاران در سال ۲۰۰۹ انجام شد تعداد بیشتری از زنان مبتلا به PCOS و گروه شاهد گنجانده شده بود(۴۲ نفر خانم مبتلا به PCOS و ۴۲ زن غیرهیپرآندروژنیک چاق که ۲۶ نفر به شدت چاق و ۱۵ نفر مبتلا به PCOS بودند. سطح واسپین سرم در همه زنان مشخص شد. علاوه بر این، سطوح واسپین سرم در ۲۶ فرد بیمار به شدت چاق بعد از عمل جراحی چاقی و در ۳۴ بیمار مبتلا به PCOS پس از درمان با متفورمین (n=19) یا یک قرص ضد حاملگی خوراکی ضد آندروژنی (n=15) مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه، غلظت واسپین سرم تحت تأثیر PCOS یا چاقی قرار نگرفت؛ همچنین سطح واسپین در گردش خون نیز در زنان با تحمل گلوکز طبیعی یا مختل شده مشابه بود. پس از عمل جراحی چاقی، که منجر به از دست دادن قابل توجه وزن و کاهش دور کمر شده، سطح واسپین سرم بدون در نظر گرفتن وجود یا عدم وجود PCOS به طور قابل توجه کاهش یافته بود. علاوه بر این، سطح واسپین سرم پس از درمان با متفورمین به مدت ۲۴ ماه اندکی کاهش یافته و در زنان تحت درمان قرار گرفته با قرص های ضد بارداری خوراکی به طور قابل توجهی افزایش یافته است. نویسندگان نتیجه گرفتند که تغییر در سطوح واسپین ممکن است یک مکانیسم جبرانی در مقابل مقاومت به انسولین و عدم تحمل گلوکز را نشان دهد(۷۹).
۳-در مطالعه سوم که توسط Cakal E و همکاران در سال ۲۰۱۰ انجام شد سطح واسپین سرم در ۲۴ بیمار مبتلا به PCOS، ۲۳ زن مبتلا به تخمدان پلی کیستیک (PCO) و در ۲۴ فرد به عنوان گروه شاهد بررسی شد. بیماران با PCOS یا تخمدان پلی کیستیک (PCO) سطوح واسپین بالاتری نسبت به گروه شاهد داشتند(۸۰).
۴-آخرین مطالعه توسط Ekaterini و همکاران در سال ۲۰۱۱ بر روی ۷۹ نفر بیمار PCOS و ۵۰ فرد داوطلب زن سالم انجام شد. بیماران مبتلا به PCOS دارای وزن طبیعی (n=5) با ۸۵۰ میلی گرم متفورمین برای مدت ۶ ماه تحت درمان قرار گرفتند. بیماران مبتلا به PCOS دارای اضافه وزن/چاق (n=54) به مدت ۶ ماه تحت تجویز یک رژیم غذایی با پروتئین طبیعی و انرژی محدود قرار گرفتند و به نیمی از آنها نیز سه بار در روز ۱۲۰ میلی گرم orlistat و بقیه یک بار در روز ۱۰ میلی گرم sibutramine داده شد. در شروع مطالعه و پس از ۶ ماه، سطوح واسپین سرم و ویژگی های تن سنجی، متابولیک و هورمونی PCOS مشخص شد. به طور کلی بیماران مبتلا به PCOS سطح واسپین بالاتری نسبت به گروه شاهد داشتند(P=0.021). بیماران مبتلا به PCOS دارای وزن طبیعی، نیز سطح واسپین بالاتری نسبت به گروه شاهد دارای وزن طبیعی داشتند(P=0.043). سطح واسپین به طور غیر معنی داری در بیماران چاق/دارای اضافه وزن مبتلا به PCOS نسبت به گروه شاهد چاق/دارای اضافه وزن بالاتر بود. در بیماران مبتلا به PCOS با وزن طبیعی، متفورمین سطح واسپین را به طور غیر معنی داری کاهش داد. در بیماران چاق/دارای اضافه وزن مبتلا به PCOS، رژیم غذایی همراه با orlistat یا sibutramine سطوح واسپین را تحت تاثیر قرار نمی داد. همچنین مشخص شد که سطح واسپین به طور مستقل با شاخص توده بدن زنان مبتلا به سندروم تخمدان پلی کیستیک (P=0.001) و با اندازه دور کمر در گروه شاهد (P=0.015) ارتباط دارد. در نتیجه، نتایج نشان دادند که سطح واسپین در مبتلایان به PCOS افزایش می یابد اما از دست دادن جزئی وزن استفاده از متفورمین، سطح واسپین را به طور معنی داری تحت تاثیر قرار نمی دهند.
این گروه نتیجه گرفتند که، اطلاعات کنونی راجع به سطح واسپین سرم در زنان مبتلا به PCOS بحث- برانگیز است و نیاز به مطالعات گسترده تر بیشتری اضافی برای روشن کردن نقش واسپین در PCOS وجود دارد (۸۱).
لذا با در نظر گرفتن نتایج مطالعات پیشین مبنی بر تغییر سطح واسپین در مبتلایان به PCOS و توجه به مکانیسم های مولکولی درگیر در تغییر سطح واسپین، مطالعه حاضر به بررسی تأثیر پلی مورفیسم rs2236242 در ژن واسپین بر ابتلا به PCOS می پردازد. امید است که در صورت یافتن ارتباط، یک مارکر مولکولی برای تشخیص افراد در ریسک گزارش شود.

فصل دوم
روش پژوهش

۲-۱- مواد و وسایل لازم جهت آزمایش های زیست شناسی مولکولی (استخراج، PCR و الکتروفورز):
۲-۱-۱- مواد لازم جهت آزمایش های زیست شناسی مولکولی:
– EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) (Merck، آلمان)
– NaOH (Merck، آلمان)
– NaCl (Merck، آلمان)
– NH4Cl (Merck، آلمان)
– Tris-HCl (Merck، آلمان)
– Taq DNA Polymerase 500U/µl (سیناژن، ایران)
– ۱۰X PCR buffer (سیناژن، ایران)
– MgCl2 25 mM (سیناژن، ایران)
– dNTP mix 10mM (سیناژن، ایران)
– Primer (تکاپوزیست، کره جنوبی)
– D.DW (داروپخش، ایران)
– Tris base (Merck، آلمان)
– Buric acid (Merck، آلمان)
– اتیدیوم بروماید (سیناژن، ایران)
– آگارز (Merck، آلمان)
– DNA ladder (100bp, ready to use) (سیناژن، ایران)
– Loading buffer (سیناژن، ایران)
– Mineral oil (سیناژن، ایران)
۲-۱-۲- وسایل لازم جهت آزمایش های زیست شناسی مولکولی
– سمپلر ۱۰-۱ میکرولیتری (Brand، آلمان)
– سمپلر ۱۰۰-۱۰ میکرولیتری (Brand، آلمان)
– سمپلر ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرولیتری (Brand، آلمان)
– سر سمپلر زرد و آبی
– میکروتیوب cc 5/0 و cc 5/1
– فالکون cc10
– سرنگ (Suppa، ایران)
– Rotator (Hidolgh، آلمان)
– ورتکس (ندای فن، ایران)
– pH متر (Horiba، ژاپن)
– Hot plate (کره)
– تانک الکتروفورز (اختریان، ایران)
– Thermocycler (T-CY or EPS 600 creacon، هلند)
– منبع تغذیه جریان الکتریکی (اختریان، ایران)
– Gel Documentation System (Cambridge، انگلیس)
– میکروسانترفوژ (Hehrin، آلمان)
– ترازوی دیجیتالی (Horiba، ژاپن)
– فالکون cc 50 (Nunc، بلژیک)
۲-۲- روش جمع آوری نمونه:
جمعیت مورد مطالعه شامل ۳۰۰ زن (۱۵۰ زن مبتلا به سندروم تخمدان پلی کیستیک و ۱۵۰ زن سالم به عنوان گروه شاهد) می باشد که از لحاظ سن (۵ ± سال) همسان سازی شدند. نمونه های خون گروه بیمار و گروه شاهد از مرکز ناباروری و جراحی های محدود زنان شیراز- دکتر رستمی جمع آوری گردید. به منظور تعیین ژنوتیپ افراد مورد مطالعه ۵ سی سی خون از آنها گرفته شد و درون تیوب های حاوی EDTA قرار داده شد. نمونه های جمع آوری شده به همراه پرسش نامه ای که توسط افراد تکمیل شده بود، به آزمایشگاه منتقل و نمونه ها در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

۲-۳- طرز تهیه محلول های مورد نیاز جهت استخراج DNA:
۲-۳-۱- طرز تهیه Lysis buffer :
۲۹/۸ گرم از آمونیوم کلرید (NH4Cl)، ۸۴/۰ گرم از (NaHCO3) و ۰۳۸/۰ گرم از اتیلن دی آمین تترا استات را با آب مقطر استریل حل نموده و به حجم Liter1 رسانیده و pH به ۷ رسانده شد.
شرایط نگهداری : در یخچال نگهداری شود.
۲-۳-۲- طرز تهیه SE buffer :
۰۹/۱ گرم از NaCl (سدیم کلرید) و ۳۲/۲ گرم از EDTA را با ۲۴۰ سی سی dH2O توسط Magnet حل نموده و pH را به کمک NaOH به ۳/۸-۸ رسانده و سپس حجم نهایی را به ۲۵۰ سی سی می رسانیم.
شرایط نگهداری : در یخچال نگهداری شود.
۲-۳-۳- طرز تهیه SDS (سدیم دو دسیل سولفات) ۱۰ درصد :
۵ گرم سدیم دو دسیل سولفات را با ۴۰ سی سی آب مقطر (dH2O) استریل حل نموده و در بن ماری حرارت می دهیم (تا حدود ۶۸ درجه، جهت حل کردن کریستال ها). سپس ارلن را با گرفتن زیر شیر آب، سرد می کنیم. ۹ سی سی آب استریل به مواد اضافه کرده و از ۵/۲ میکرولیتر HCl جهت رساندن pH = 7.2 استفاده می شود. حجم را به ۵۰ سی سی می رسانیم.
۲-۳-۴- طرز تهیه نمک اشباع:
۲۰ میلی لیتر آب مقطر را در یک فالکون ۳۰ میلی لیتری ریخته و سپس مقداری نمک را به فالکون اضافه کرده و مخلوط می کنیم. این کار را آنقدر تکرار می کنیم که دیگر نمک در آب حل نشود و آب از نمک اشباع شود.
۲-۴- روش Salting out استخراج DNA :
۱- دو سی سی نمونه خون را در لوله آزمایش ریخته و سه برابر آن Lysis buffer اضافه می کنیم. درب لوله ها را با پارافیلم بسته و چند بار به آرامی سر و ته می کنیم تا خوب مخلوط شوند.
۲- نمونه ها را برای ۲۰ دقیقه در یخچال قرار می دهیم. در این مدت هر ۵ دقیقه آنها را سر و ته می کنیم.
۳- نمونه ها را پس از خروج از یخچال به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۸۰۰-۲۰۰۰ سانتریفوژ می کنیم.
۴- مایع رویی را به آرامی خالی کرده تاحدود ۱-۵/۱ سانتی متر از نمونه ته لوله باقی بماند و مجدداً ۳ برابر حجم محلول باقی مانده Lysis buffer اضافه می کنیم و درب لوله ها را با پارافیلم می- بندیم و بهم می زنیم و مراحل قبل را تا جایی تکرار می کنیم تا رسوب سفید مایل به صورتی حاصل شود.
۵- مایع را به طور کامل خارج کرده و آب اضافی را با دستمال می گیریم. هم حجم خون اولیه (۲ سی سی) SE buffer اضافه می کنیم و کمی بهم می زنیم. ۲۰۰ میکرولیتر SDS و ۱۴ میکرولیتر پروتئیناز K نیز به حالت مایل اضافه می کنیم. درب لوله را با پارافیلم می بندیم و خوب به هم می زنیم تا رسوب از ته لوله جدا شود و لوله ها را ورتکس می کنیم.
۶- نمونه ها به مدت ۱۶ ساعت (over night) در بن ماری ۵۶ در جه سانتی گراد قرار داده می شوند.
۷- به نمونه ها پس از خروج از بن ماری ۹۰۰ میکرولیتر نمک اشباع اضافه کرده و کمی بهم می زنیم و ۱۷۰۰ میکرولیتر کلروفرم اضافه می کنیم و سپس به مدت ۵/۱ ساعت با دور ۳۵۰۰ سانتریفوژ می کنیم.
۸- در این مرحله در لوله ها سه فاز تشکیل می شود: فاز اول شامل نمک است، فاز روی آن غشاهای سلولی و سایر ترکیبات ناشی از تخریب سلول ها به صورت یک لایه سفید رنگ دیده می شود، مایع رویی حاوی DNA می باشد.
۹- مایع شفاف رویی را با دقت جدا کرده و در لوله دیگری که اتوکلاو شده است می ریزیم. حدود ۳-۲ برابر مایع اتانول ۹۶ درصد (مطلق) اضافه می کنیم. لوله ها را به آرامی تکان داده تا کلاف DNA ظاهر گردد.
۱۰- کلاف DNA را با سمپلر ۱۰۰۰ برداشته و در تیوب ۵/۱ میلی لیتر می ریزیم. ۲۰ ثانیه با دور ۱۲۰۰۰ نمونه ها را سانتریفوژ کرده و سپس کل الکل را خارج می کنیم.
۱۱- دو الی سه بار اتانول ۷۰ درصد به مقدار ۱۰۰ میکرولیتر به نمونه ها اضافه می کنیم و هر بار سانتریفوژ کرده و الکل را خارج می کنیم.
۱۲- نمونه ها را به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه زیر هود یا فضای

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید